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电转化感受态细胞制备

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  感受态细胞制备目前常用的方法有传统的Cacl2法和电转化法,电转化法比较Cacl2法具有操作简便,转化效率高的优势,本文将会介绍电转化感受态细胞的原理,实验流程与注意事项。

感受态细胞

电转化感受态细胞实验原理

  转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞,并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程,利用理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔,因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对树生长前期的细胞,以使细胞悬浮液中应含有尽?#21487;?#30340;导电离子。

电转化感受态细胞实验流程

1.划单菌落:倒一个普通的无抗性的LA培养皿,利用感受态菌株,划单菌落,37℃培养约15hrs(推荐时间:第一天8:00am-11:00pm)。

2.接菌:用20ml的半盐LB培养基接菌,摇菌约11hrs(推荐时间:第一天11:pm-第二天10:00am)。

3.扩大培养:将菌液接入200ml/瓶的半盐LB培养基中,每瓶2ml(1%体积比),扩大培养细菌约3hr(第二天11:00am-2:30pm),根据不同的感受态菌株,从2.5hr起开始吸1ml菌液测OD值,当OD600值为0.4-0.6之间时,细菌处于指数生长前期。将摇好的菌液放在冰上预冷10min以上(半小时),并不间断摇匀菌液(期间摇晃数次是菌体温度均匀)。以下所有操作均在冰上进行

4.搜集菌体:离心机4度预冷。将预冷的菌液倒入4个500ml离心管中,利用天平两两配平,4度5000rpm离心12min收集菌体,弃去上清,用灭菌吸水纸擦干瓶口。

5.双蒸水清洗1次:先加入5ml左右的预冷双蒸水,用移液器上下吸动将菌体捶打均匀,并将4瓶菌体两两合并成为2瓶。每瓶倒入灭菌双蒸水约400ml,利用天平配平,剧烈震荡数次以保证混匀,4度4000rpm离心12min收集菌体,弃上清,注意勿将菌体倒出,并用灭菌吸水纸擦干瓶口。

6.10%甘油清洗两次:重复以上操作,利用预冷的10%的甘油代替灭菌双蒸水水清洗两次,并且将两瓶菌体合并成为一瓶,利用废弃液体配平离心。

7.分装:视最后的菌体的体积加入适量10%甘油(清洗过程中菌体损失会导致菌体较少则少加甘油;最后一次离心后弃上清时残留的液体过多则少加或不加;正常情况下推荐加10%甘油2.5ml)。利用移液器将菌体上下吸动吹打均匀,将菌液转移到1.5ml或2ml的离心管(冰上)。并分装至500ul离心管中,30ul/管,放入液氮中冷冻后,于-80度冰箱保存。

电转化感受态细胞注意事项

1.所有用到物品均用双蒸水洗涤,配置,并灭菌烘干,在使用之前-20度预冷

2.划好的单菌落立即使用,勿放入冰箱储存,以免影响细菌活力。

3.在摇好的菌液放在冰上预冷时需不时摇动菌液。

4.收集菌体之后的所有操作均在冰上进?#23567;?/p>

5.弃去上清时,应缓慢操作,注意不要将菌体倒出。

相关阅?#31890;?br> 《质粒转染操作步骤与注意事项

 

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