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免疫共沉淀(Co-IP实验)技术服务案例

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Co-IP技术服务案例 QQ技术支持

1、实验设计

用预先固化在argarose beads上的Protein A的?#22266;?#20813;疫沉淀A蛋白,与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。

2、试剂和耗材

样品:(1). HEK293未转染细胞
   (2). 对照组pcDNA3.1-flag +pcDNA3.1-xx
   (3).实验组pcDNA3.1-3D-Flag+pcDNA3.1-xxx

名称 公司 名称 公司
?#22266;澹篎lag,cMyc 钟鼎生物 Protein Marker 钟鼎生物
Acr、Bis、Tris Sigma公司 SDS Amresco公司
TEMED BIO-RAD公司 其它试剂均为国产分析纯

3、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司 台式高速离心机 德国SORVAL公司
Gel Doc2000?#19978;?#31995;统、垂直电泳系统 美国BIO-RAD公司 320-S pH计 美国Mettler Toledo公司
AR5120电子天平 美国AHOΜS公司 MultiTemp III 恒温水浴锅 雪花状制冰机 日本SANYO公司
超净工作台 中国苏净集团 NANODROP2000 Thermo公司

4、实验步骤

4.1、样品制备

(1) 取样品?#26469;?#21152;入适量的裂解液混匀,在冰上充分裂解。
(2) 将细胞裂解液转移到 1.5 ml EP管内,于冷冻离心机 4℃,12000 rpm 离心 10 min。
(3) 将离心后的上清液分为两份:一份 40 μl,加入10 μl 5×SDS sample buffer, 混匀后于100℃煮 10 min,作为总细胞裂解液于-20℃保存,Western blot 检测目的蛋白的表达水平。

4.2、免疫沉淀

(1) 各取30 μl Protein A置于离心机2000 rpm 弃上清,在用PBS洗涤2次。加入300 μl细胞裂解液4度旋转仪4h(消除样品中非特异性结合的影响)。
(2) 4℃,4000 rpm 离心 5 min,弃去沉淀,保留上清。
(3) 上清中加入已经平衡10 μl ?#22266;錋,置于4℃旋转仪上旋转4 h,让抗原a和?#22266;錋充分结合。
(4) 加入30 μl已经平衡好的 Protein A置于4℃旋转仪上旋转4 h,让抗原a和?#22266;錋复合物与protein A充分结合。
(5) 离心,弃上清。沉淀用PBS洗3遍。
(6) 用PH1.5甘氨酸50 μl在冰上洗脱混匀20 min。
(7) 离心10000 rpm 2 min取上清为免疫复合物洗脱液,加入5×SDS sample buffer混匀后 100℃煮10 min。用于后续SDS-PAGE电泳或Western blot检测。

4.3、Western Blot 检测

(1) 取总细胞裂解液,加loading buffer煮沸冷却后上样。
(2) 电泳条件:4%浓缩胶:90 V, 30 min; 15%分离胶:120 V, 90 min。
(3) 电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒流250 mA转膜,约为1h。
(4) 电转结束后,取下膜后先用PBST洗涤4次,每次5 min。
(5) 将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1 h。
(6) 用PBST稀释一抗,膜在一抗稀释液中4℃过夜。
(7) 次日将膜取出后用PBST 洗膜4次,每次5 min。
(8) 用含5%脱脂奶粉的封闭?#21512;?#37322;二抗。膜在二抗中37℃反应1 h。
(9) 反应完毕后,把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次,每次5 min。
(10) ECL显影,曝光。

5、实验结果

编号 ?#22266;?#21517;称 稀释比例 二抗名称 稀释比例
1 Flag 1:1000 羊抗鼠 1:5000
2 cMyc 1:5000 羊抗鼠 1:5000

 

蛋白互作验证

用预先固化在argarose beads上Flag的?#22266;?#20813;疫沉淀带Flag标签的B蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白所带标签GFP进行检测,进而证明两者间的相互作用

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